Ang unang kaso ng genetic manipulation sa isang butiki ay lumikha ng isang modelong organismo na maaaring makatulong sa karagdagang pag-unawa sa ebolusyon at pag-unlad ng reptile.
CRISPR-Cas9 o simple CRISPR ay isang kakaiba, mabilis at mura gene tool sa pag-edit na nagbibigay-daan sa pag-edit ng isang genome sa pamamagitan ng pagtanggal, pagdaragdag o pagbabago DNA. Ang CRISPR acronym ay nangangahulugang 'Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. Ang tool na ito ay simple at mas tumpak kaysa sa mga nakaraang pamamaraan na ginamit para sa pag-edit DNA.
Ang CRISPR-Cas9 tool ay nag-iinject ng mga organismo sa zygote (one-cell) stage na may DNA construct na gawa sa (a) Cas9 enzyme na nagsisilbing 'gunting' at maaaring mag-cut o magtanggal ng bahagi ng DNA, (b) gumagabay sa RNA - isang sequence na tumutugma sa target na gene at sa gayon ay ginagabayan ang Cas9 enzyme sa target na lokasyon. Sa sandaling maputol ang isang target na seksyon ng DNA, muling sasali ang makinarya sa pag-aayos ng DNA ng cell sa natitirang strand at, sa proseso, patahimikin ang naka-target na gene. O ang gene ay maaaring 'itama' sa pamamagitan ng paggamit ng bagong binagong DNA template sa isang proseso na tinatawag bilang homology directed repair. Kaya, ang tool ng CRISPR-Cas9 ay nagbibigay-daan para sa mga pagbabago sa genetic sa pamamagitan ng pag-iniksyon pag-edit ng gene solusyon sa isang single-celled fertilized egg. Ang prosesong ito ay nagdudulot ng genetic alteration (mutation) sa lahat ng kasunod na mga cell na ginawa kaya nakakaapekto sa gene function.
Bagama't ang CRISPR-Cas9 ay karaniwang ginagamit sa maraming uri ng hayop kabilang ang mga isda, ibon at mammal, hanggang ngayon ay hindi pa ito naging matagumpay sa genetically manipulating reptile. Pangunahin ito dahil sa dalawang hadlang. Una, ang mga babaeng reptilya ay nag-iimbak ng tamud nang mahabang panahon sa kanilang oviduct na nagpapahirap sa pagtukoy ng eksaktong oras ng pagpapabunga. Pangalawa, ang pisyolohiya ng mga itlog ng mga reptilya ay may maraming mga tampok tulad ng nababaluktot na mga shell ng itlog, pagkasira na walang espasyo sa hangin sa loob na ginagawang mahirap manipulahin ang mga embryo nang hindi nagiging sanhi ng pagkalagot o pinsala.
Sa isang artikulong na-upload sa bioRxiv noong Marso 31, 2019, iniulat ng mga mananaliksik ang pagbuo at pagsubok ng isang paraan upang magamit ang CRISPR-Cas9 pag-edit ng gene sa mga reptilya sa unang pagkakataon. Ang mga reptile species na pinili sa pag-aaral ay isang tropikal butiki tinatawag Anolis sagrei o mas karaniwang brown anole na laganap sa Caribbean. Ang mga butiki sa pag-aaral ay nakolekta mula sa isang ligaw na rehiyon sa Florida, USA. Ang species na ito ay angkop na angkop para sa pag-aaral dahil sa maliit na sukat nito, mahabang panahon ng pag-aanak at medyo maikling average na oras sa pagitan ng dalawang henerasyon.
Upang malampasan ang mga limitasyon na kasalukuyang kinakaharap ng mga reptilya, ang mga mananaliksik ay nag-microinjected ng mga bahagi ng CRISPR sa mga hindi pa nabubuong itlog habang ang mga itlog ay nasa mga ovary ng babaeng butiki bago ang pagpapabunga. Tinarget nila ang tyrosinase gene na gumagawa ng enzyme na kumokontrol sa pigmentation ng balat sa mga butiki at kung aalisin ang gene na ito ang butiki ay ipanganak na isang albino. Ang malinaw na pigmentation phenotype na ito ang dahilan upang piliin ang tyrosinase gene. Ang mga microinjected na itlog pagkatapos ay mature sa loob ng babae at pagkatapos ay natural na pinataba sa isang ipinakilalang lalaki o nakaimbak na tamud.
Bilang resulta, apat na albino lizard ang ipinanganak makalipas ang ilang linggo na nagpapatunay na ang gene tyrosinase ay na-deactivate at ang pag-edit ng gene naging matagumpay ang proseso. Dahil ang mga supling ay naglalaman ng na-edit na gene mula sa parehong mga magulang, malinaw na ang mga bahagi ng CRISPR ay nanatiling aktibo nang mas matagal sa immature oocyte ng ina at post fertilization, na-mutate nito ang paternal genes. Kaya, ang mutant albino lizards ay nagpakita ng manipulated tyrosinase sa mga gene na minana mula sa ina at ama dahil ang albinism ay isang katangian na minana mula sa parehong mga magulang.
Ito ang kauna-unahang pag-aaral na epektibong gumawa ng genetically modified reptile. Ang pananaliksik ay maaaring gumana sa katulad na paraan sa iba pang mga species ng butiki tulad ng mga ahas kung saan ang mga kasalukuyang diskarte ay hindi matagumpay sa ngayon. Ang gawaing ito ay maaaring makatulong sa karagdagang pag-unawa sa ebolusyon at pag-unlad ng reptile.
***
{Ang pag-aaral na ito ay kasalukuyang isinumite para sa peer review. Maaari mong basahin ang preprint na bersyon sa pamamagitan ng pag-click sa DOI link na ibinigay sa ibaba sa listahan ng (mga) binanggit na pinagmulan}
Pinagmulan (s)
Rasys AM et al. 2019. Preprint. CRISPR-Cas9 Gene Editing sa Lizards Sa pamamagitan ng Microinjection ng Unfertilized Oocytes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
